2004年，参演电视剧《搭错车》，饰演反一号苏民生。2009年，在古装剧《三国》中饰演刘备。2011年，与王丽坤主演电视剧《青盲之越狱》。
2011年获南方盛典最佳男演员奖《幸福在路上》，2012年5月22日获得MSN星月年度最具价值男演员奖。2016年，主演三国战争题材权谋古装剧《军师联盟》。
2017年9月16日，凭借《我不是潘金莲》获得第31届中国电影金鸡奖最佳男配角。同年，于和伟担纲艺术总监并领衔主演电视剧《猎毒人》。
个人生活上，1991年于和伟与宋林静相恋，1996年，两人同时毕业，并被同时招进了南京军区前线话剧团。他们相识19年、结婚13年。
出道以来，于和伟塑造了很多经典角色，是公认的有颜值有演技的戏骨。虽入“叔圈”，但于和伟始终保持一颗年轻的心，对时下潮流的名词诸如叔圈、C位了如指掌。
对此，于和伟曾谈到自己的秘籍“生活中总要有新鲜的生活态度和热情”。入行以来，他刻画了多种不同类型的人物风格，在“塑造人物”中追求完美。
在《一出好戏》的拍摄过程中，为了达到最好的效果，在二度创作中他也会进行多种演绎以供导演选择。面对年轻演员，他会悉心指导积极配合并给予其自信，亲切有加，毫无距离之感。
